پیشرفت های علمی در کنترل عفونت های نوزما سرانا ( Microsporidia )

زنبورهای عسل ( Apis mellifera ) از جمله گرده افشان های مهم کشاورزی هستند که اخیراً در معرض خطر تلفات شدید کلنی قرار گرفته اند. انواع انگل‌ها و پاتوژن‌ها از جمله انگل میکروسپوریدی Nosema ceranae با کاهش کلونی مرتبط هستند. در حالی که فوماژیلین برای چندین دهه برای کنترل نوسموزیس در کلنی های زنبور عسل مدیریت شده استفاده شده است، تحقیقات نشان می دهد که این آنتی بیوتیک یک تهدید سمی است و اثربخشی آن در برابر N. ceranae نامشخص است. مطمئناً تقاضا برای یک داروی دامپزشکی جدید برای درمان کلنی های زنبور عسل آلوده به N. ceranae وجود دارد .

؛؛ در این بررسی پیشرفت‌های علمی اخیر در کنترل عفونت N. ceranae در زنبورهای عسل دنبال می‌شود.

معرفی
زنبورهای عسل ( Apis mellifera ) گرده افشان هایی با ارزش اقتصادی قابل توجه در سراسر جهان هستند و مسئول گرده افشانی بسیاری از محصولات مهم زیست محیطی و کشاورزی هستند . کلنی های زنبور عسل مدیریت شده در چندین دهه گذشته، به ویژه در آمریکای شمالی، رو به کاهش بوده است . این کاهش به دلیل نقش حیاتی زنبورهای عسل در حفظ منابع غذایی انسان و دام باعث نگرانی فزاینده می شود . تلفات کلنی با قرار گرفتن در معرض آفت کش ها، استرس محیطی و مهاجرتی و تغذیه نامناسب مرتبط است. با این حال عفونت های انگل و پاتوژن ، احتمالاً عوامل اصلی مؤثر در مرگ و میر کلنی ها هستند.

Nosema ceranae یک انگل داخل سلولی میکروسپوریدی است که زنبورهای عسل توسط آن عفونی می شوند .در حالی که Nosema apis و N. ceranae هر دو زنبورهای عسل را انگلی می کنند، اما N. ceranae از نظر وضعیت فراگیری جغرافیایی بهتر از N. apis است.عفونت‌های شدید N. ceranae (نوسموزیس) می‌تواند باعث مرگ و میر زنبورها شود و با تلفات کلنی‌ها مرتبط است.N. ceranae همچنین با اختلالات فیزیولوژیکی بیمارگونه از جمله عملکرد سیستم ایمنی سرکوب شده، رفتار جستجوی غذا، تولید فرمون و هورمون، و سنتز لیپید همراه است.

N. ceranae  یک انگل قارچی اسپورساز است که از طریق عسل، شهد، گرده و مواد مدفوع زنبور عسل به صورت خوراکی منتقل می شود. چرخه تولید مثلی نوزما اندکی پس از ورود به دستگاه گوارش میزبان شروع می شود. به دنبال جوانه زنی در مجرای روده میانی، فشار اسمزی محیطی باعث می شود که اندامک تخصصی به نام لوله قطبی از هاگ بیرون زده و اسپوروپلاسم (مواد عفونی) را به سیتوپلاسم میزبان تزریق کند. سپس مرونت ها تکثیر می شوند و به هاگ های اولیه بالغ می شوند که در داخل سلول میزبان جوانه می زنند و ممکن است سلول های مجاور را به طور خودکار آلوده کنند. هاگ های اولیه همچنین ممکن است به هاگ های محیطی کاملاً تشکیل شده تبدیل شوند که از طریق لیز سلولی در مجرای روده میانی آزاد می شوند. در اینجا چرخه تولید مثل تکرار می شود یا هاگ های آزاد دفع می شوند.

زنبورهای عسل نیز مانند دام در صورت آلوده شدن به انگل ها یا پاتوژن ها به درمان های دامپزشکی توسط زنبورداران یا کشاورزان نیاز دارند.

فوماژیلین که اولین بار در سال 1949 از قارچ Aspergillus fumigatus تهیه شد، برای درمان نوسموز ناشی از N. apis در زنبورهای عسل برای چندین دهه استفاده شده است. با این حال مطالعات اخیر نشان می دهد که این آنتی بیوتیک ممکن است در برابر عفونت های N. ceranae بی اثر باشد.همچنین شواهدی وجود دارد که فوماژیلین نسبتاً سمی است و باعث انحرافات کروموزومی، سرطان زایی در انسان و تغییر در ساختار غدد هیپوفارنژیال در زنبورها می شود. در نتیجه بسیاری از کشورهای خارج از قاره آمریکا (از جمله اتحادیه اروپا) فوماژیلین را برای استفاده در کشاورزی ممنوع کرده اند (MRL؛ کمیسیون مقررات، اتحادیه اروپا، 2010، شماره 37/2010).

بنابراین، تقاضای قابل توجهی برای داروی جدیدی وجود دارد که به طور ایمن و مؤثر کلنی های زنبور عسل آلوده به N. ceranae را درمان کند. پیشرفت های علمی مولکولی، گیاه درمانی و مبتنی بر مکمل های اخیر که هدف آنها کنترل نوسموز در زنبورهای عسل است (جدول 1) در اینجا خلاصه شده و مورد بحث قرار گرفته است.

میز 1 . خلاصه و مقایسه درمان‌های ضد N. ceranae که در کارهای قبلی کارایی خود را نشان داده‌اند.

مولکول های کوچک
مطالعه فعالیت بیولوژیکی مولکول های کوچک یک استراتژی امیدوارکننده برای کشف یک درمان جدید ضد نوزما را ارائه می دهد . یک روش جدید کشت سلولی N. ceranae را می توان با فرمت میکروپلیت  96 wellتطبیق داد، بنابراین سنجش های غربالگری دارویی با توان بالا و متوسط ​​را روی N. ceranae امکان پذیر و کارآمد می کند

بنابراین سنجش های غربالگری دارویی با توان بالا و متوسط روی N. ceranae امکان پذیر و کارآمد می شود. دو ترکیب نیترویمیدازول (مترونیدازول و تینیدازول) که زنده ماندن N. ceranae را در شرایط آزمایشگاهی با سمیت سلولی کم ، بسیار کاهش می دهند، با استفاده از این روش شناسایی شده اند. در حالی که روش توصیف شده می تواند در غربالگری تعداد زیادی از مولکول ها مفید باشد، احتمال استفاده از این دو ترکیب در داروی زنبورستان کم است، زیرا ترکیبات نیترویمیدازول توسط بسیاری از کشورها برای استفاده در درمان حیوانات غذایی تایید نشده است . (MRL؛ مقررات کمیسیون، اتحادیه اروپا، 2010، شماره 37/2010).

یک مطالعه جدیدتر هم در شرایط آزمایشگاهی و هم در داخل بدن فعالیت پورفیرین ها را در برابر N. ceranae آزمایش کرد. پورفیرین ها ترکیبات هتروسیکلیک معطر هستند که در طبیعت حفظ شده اند و در بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی از جمله انتقال اکسیژن و فتوسنتز نقش دارند . درمان هاگ ها و زنبورهای آلوده با پورفیرین های غیرفلزی انتخابی PP(Asp)2] و [TMePyP در شربت قند به طور قابل توجهی باعث کاهش زنده ماندن میکروسپوریدین در شرایط آزمایشگاهی، کاهش سطح آلودگی زنبورهای عسل تلقیح شده تا 5 برابر و فقط افزایش بقای زنبورهای [PP( Asp)2]شد.

محققان فرض می‌کنند که پورفیرین‌ها ممکن است بر روی دیواره سلولی یا غشاء اثر بگذارند، زیرا تغییر شکل‌هایی در لایه‌های اگزوسپوریوم اسپور به دنبال پیش تیمار هاگ مشاهده شد.قابل توجه است که مهار آنزیم متیونین آمینوپپتید از نوع 2 (MetAP2) مکانیسم پیشنهادی فوماژیلین در برابر نوزما است. MetAP2 به طور خاص برش متیونین آغازگر را در ترمینال N پروتئین های تازه سنتز شده ، کاتالیز می کند و عملکرد مهمی را در اصلاح پس از ترجمه ایفا می کند. اگرچه اکثر حیوانات دو ایزوفرم کاربردی MetAP (MetAP1 و MetAP2) را بیان می کنند، میکروسپوریدیا فقط MetAP2 را بیان می کنند. بنابراین استفاده از آنتاگونیست‌های MetAP2 برای هدف قرار دادن نوزما می‌تواند یک استراتژی مناسب برای کنترل نوسموز در زنبورهای عسل باشد. "ون دن هیور و همکاران" اخیراً چندین آنالوگ فوماگیلین (و سایر ترکیبات تجاری موجود) را در آزمایشات قفس ، غربال کردند و کاهش قابل توجهی در بارهای N. ceranae مشاهده کردند.

اگرچه نویسندگان اثربخشی را نشان می دهند ولی هیچ یک از ترکیبات آزمایش شده به اندازه فوماژیلین در از بین بردن هاگN. ceranae موثر نبود. با توجه به مقررات سختگیرانه در مورد استفاده از آنتی بیوتیک ها در حیوانات غذایی، اقدامات احتیاطی باید در توسعه و تایید مهارکننده های جدید MetAP2 برای طب زنبورستان انجام شود.

استفاده مجدد از داروهای زنبور عسل که در حال حاضر استفاده می شوند ممکن است یکی دیگر از استراتژی های مطلوب برای کنترل N. ceranae باشد. اسید اگزالیک و فرمیک که توسط زنبورداران برای سرکوب کنه‌های واروآ (اکتوانگل‌های ویرانگر زنبور عسل) به‌عنوان قارچ‌کش استفاده می‌شوند، N. ceranae را در آزمایش‌های آزمایشگاهی و مزرعه‌ای غیرفعال کرده‌اند. در یک آزمایش بخور داخلی " آندروود و کری " خاطرنشان کردند که بخور اسید فرمیک باعث کاهش بار اسپور Nosema در کلنی‌ها در طول یک سال می‌شود.درمان‌های بخور داخل کندو، اگرچه به طور بالقوه مؤثر هستند، ولی احتمالاً در سطح زنبورداری تجاری مقرون به صرفه و عملی نیستند.

،، یک روش عملی تر استفاده از بخارات طبیعی ایجاد شده توسط ترکیبات حل شده یا مایع، مشابه درمان موضعی کنه واروآ اسید فرمیک، اسید اگزالیک، و غیره است.

"نانتی و همکاران" با استفاده از این مفهوم، درمان‌های اسید اگزالیک خوراکی (0.25 غلظت در شربت قند) را در زنبورهای عسل در قفس و درمان‌های موضعی در آزمایش‌های مزرعه‌ای برای کاهش قابل‌توجه میزان عفونت و افزایش بقای کلنی در مقایسه با گروه شاهد به کار بردند.این یافته ها قابل توجه هستند زیرا کنه های واروآ معمولاً با درمان های موضعی و غیر خوراکی کنترل می شوند. استفاده از درمان‌های موضعی و تولید کننده بخار ممکن است نسبت به داروهای خوراکی مزایایی داشته باشد.

سایر ترکیبات فنلی که معمولاً برای مبارزه با آلودگی کنه‌های واروآ استفاده می‌شوند، به ویژه رسوراترول و تیمول ، در مهار N. ceranae در آماده‌سازی‌های خوراکی مؤثر هستند.بررسی های توام بقای کلنی های بزرگتر و مطالعات سمیت هنوز برای این درمان ها مورد نیاز است، این مطالعات نشان می دهد که برخی از اسیدهای آلی، فنولیک ها و سایر ترکیبات مانع زنده ماندن N. ceranae می شوند و ممکن است با توجه به نیاز مداوم به کنه کش ها در درمان زنبورستان، کاربردهای درمانی داشته باشند.اکثر درمان‌های تجربی نوزما ، اسپورهای موجود در دستگاه گوارش زنبور عسل را هدف قرار می‌دهند و هاگ‌های زنده در ساختار کندو، شانه‌های شهد و مدفوع را برای آلوده کردن مجدد باز می‌گذارند.

مطالعات آینده می تواند به طور کامل تر دوز و هم افزایی بین انواع درمانی که هاگ ها را در مراحل مختلف زندگی هدف قرار می دهند، بررسی کند.به عنوان مثال ترکیب درمان های موضعی تولید کننده بخار (مانند پدهای آغشته به اسید اگزالیک) با داروهای خوراکی، ممکن است هم اسپورهای تولید مثلی و هم اسپورهای آزاد را در محیط کندو از بین ببرد و در عین حال کنه های واروآ را نیز کنترل کند.

تداخل اسید ریبونوکلئیک یا RNA
بررسی RNAi ممکن است در کشف اهداف و درمان های جدید برای عفونت زنبور عسل N. ceranae استفاده شود. RNAi یک مکانیسم خاموش کردن ژن پس از رونویسی است که توسط RNA دو رشته ای (dsRNA) متصل به توالی رونوشت همولوگ یک ژن هدف هدایت می شود. علاوه بر این RNAi یک مکانیسم طبیعی ضدعفونی پاسخ ایمنی زنبور عسل است.

RNAi در حال حاضر برای فعالیت های درمانی در پزشکی انسانی و فعالیت آفت کش ها در کشاورزی در حال بررسی است. مهار کنه های واروآ و چندین ویروس RNA عفونی زنبور عسل نیز توسط RNAi انجام شده است. کار قبلی RNAi ژن های ناقل نوکلئوتید نوزما را برای کنترل نوسموز در زنبورهای عسل به کار برده است. ژنوم N. ceranae قبلا با ویژگی بالای ایزوفرم های انتقال دهنده ATP/ADP توالی یابی شده است.پروتئین های ناقل ATP/ADP برای حفظ فرآیندهای فیزیولوژیکی میکروسپوریدی مهم هستند.

این مطالعه نشان داد که سطوح رونوشت هدف و بارهای اسپور میزبان کاهش می‌یابد زمانی که زنبورهای عسل دوزهای روزانه dsRNA مصنوعی (در شربت قند) مخصوص ناقل‌های N. ceranae ATP/ADP را مصرف می‌کنند. علاوه بر این پاسخ زنبور کارگر به ساکارز (با اندازه‌گیری رفلکس اکستنشن پروبوسیس) که در طول عفونت‌های N. ceranae افزایش می‌یابد ، در غلظت‌های پایین ساکارز به دنبال درمان RNAi کاهش می‌یابد.

یک مطالعه جدیدتر از RNAi برای کاهش بیان پروتئین لوله قطبی 3 (ptp3) استفاده کرد، پروتئینی که برای تزریق اسپوروپلاسم و تهاجم سلولی میکروسپوریدی ضروری است. هنگامی که ptp3 از طریق مصرف dsRNA از بین می‌رود، بارهای اسپور میزبان کاهش می‌یابد، چندین پپتید ضد میکروبی (آباسین، آپیدایسین، هیمنوپتاسین، دیفنسین-1) که معمولاً توسط عفونت‌های N. ceranae تنظیم می‌شوند ، افزایش می‌یابند و بقا به طور قابل‌توجهی تنظیم می‌شود. ژن N. ceranae Dicer نیز به عنوان یک هدف احتمالی RNAi شناسایی شده است و ممکن است پیامدهایی در جهت به حداقل رساندن عفونت‌پذیری در هنگام کوبیدن داشته باشد.

علاوه بر هدف قرار دادن ژن های N. ceranae به طور خاصRNAi  برای کاهش بیان تنظیم کننده های منفی پاسخ ایمنی زنبور عسل به کار گرفته شده است . نشان داده شده است که عفونت‌های N. ceranae چندین ژن ایمنی را در زنبور عسل کاهش می‌دهند و ژن کوتیکول (nkd) یک آنتاگونیست مسیر WNT و تنظیم‌کننده مهم عملکرد ایمنی را تنظیم می کند. به دنبال مصرف dsRNA که nkd را هدف قرار می دهد، سطوح عفونت کمتر و افزایش بیان ایمنی و بقا در زنبورها مشاهده می شود.

از بین بردن ژن های مهم برای زنده ماندن N. ceranae یا تنظیم ایمنی زنبور عسل با واسطه RNAi ممکن است پتانسیل کنترل بیماری نوزما را داشته باشد. با این وجود هنگام ارزیابی امکان سنجی داروهای زنبور عسل مبتنی بر RNAi باید چندین مانع در نظر گرفته شود. تغذیه خوراکی dsRNA به زنبورهای عسل ممکن است کارایی و پایداری RNAi را کاهش دهد، زیرا آنزیم‌های گوارشی و pH روده می‌توانند به سرعت متابولیزه شوند و توالی دارو را قبل از تحویل به mRNA هدف تغییر دهند.

 یک پوشش مصنوعی (به عنوان مثال، نانوذرات/لیپوزوم) ممکن است محافظت ایجاد کند اما همچنین می تواند هزینه های تولید را افزایش دهد . اثرات خارج از هدف و غیراختصاصی RNAi یکی دیگر از نگرانی‌های عمده در کشاورزی است که احتمالاً تأیید درمان‌های مبتنی بر RNAi برای طب زنبورستان را کند می‌کند. اگرچه بسیاری از کاربردهای RNAi به طور کامل مورد بررسی قرار گرفته است، هیچ دارو یا آفت کش مبتنی بر RNAi برای استفاده کشاورزی تایید نشده است. تنها کاربرد تایید شده توسط EPA از RNAi در کشاورزی، سویه‌ای از ذرت است که از نظر ژنتیکی اصلاح شده برای بیان dsRNA هدف‌دار کرم ریشه است (93). RNAi مطمئناً ارزشی در شناسایی اهداف دارویی بالقوه N. ceranae نشان داده است، اما تحقیقات بیشتری برای نشان دادن اینکه RNAi به عنوان یک درمان در صنعت زنبورداری ایمن، مقرون به صرفه و عملی است، مورد نیاز است.

عصاره ها و مکمل های طبیعی
اثرات عصاره های آلی و مکمل های طبیعی بر عفونت های N. ceranae به طور گسترده مورد بررسی قرار گرفته است. چنین تیمارهایی برای کشاورزان و دوستداران محیط زیست جذاب هستند زیرا سمیت کمتر در مقایسه با سایر تیمارهای شیمیایی نگران کننده است. در واقع نشان داده شده است که عصاره های مختلف محصولات طبیعی آلی و آبی باعث افزایش بقای زنبور عسل و کاهش بار اسپور پس از درمان خوراکی می شوند.

لازم به ذکر است که عصاره اتانولی بره موم توسط "Yemor et al ، Suwannapong و همکاران" در گونه های مختلف زنبور عسل (Apis florea و Apis ceranae) که در سطح جهانی گرده افشان کمتری نسبت به زنبورهای عسل هستند، آزمایش شدند. ترکیبات طبیعی به ویژه فلاونوئیدها، در چندین عصاره گیاهی که فعالیت ضد میکروسپوریدی را در زنبورهای عسل نشان می‌دهند، شناسایی شده‌اند. اگرچه فلاونوئیدها به عنوان منبع این فعالیت تأیید نشده‌اند.

"براوو و همکاران" فعالیت ضد نوزما in vivo مشابه فوماژیلین در عصاره های تقطیر هیدرولیکی اسانس (EO) از برگ های کریپتوکاریا آلبا را گزارش کردند. مونوترپن‌های منتخب (β-فلاندرن، اکالیپتول و α-ترپینئول) شناسایی شده در عصاره نیز N. ceranae را مهار کردند.

جالب توجه است که ترکیب شیمیایی عصاره‌های خام معمولاً پیچیده و اغلب ناشناخته است. برای مثال خلوص و ترکیب مولکولی عصاره گیاه و بره موم بین دسته‌های عصاره و منابع بسیار متفاوت است. با این حال، این تغییرات ممکن است تأثیر قابل توجهی بر قدرت محصول داشته باشد. تولید عصاره ها و درمان های مبتنی بر مکمل زنبور عسل باید بسیار استاندارد باشد تا اطمینان از کارایی در این زمینه فراهم شود.

مکمل های تجاری برای فعالیت در برابر نوسموز مورد مطالعه قرار گرفته اند. کلنی های تکمیل شده با پنتادکاپپتید معده BPC 157، یک پپتید ضد زخم که به خوبی مطالعه شده است، افزایش جمعیت کلونی زنبورهای کارگر، تعداد اسپور کمتر و ضایعات محدود در روده میانی زنبورهای آلوده را نشان داد ولی طول آزمایش برای نشان دادن تأثیر بر بقای کلنی کافی نبود.

علاوه بر این یک مجموعه اسید آمینه و ویتامین در رژیم غذایی به نام BEEWELL AminoPlus بار اسپور را کاهش می دهد و زنبورهای عسل را از سرکوب سیستم ایمنی با افزایش بیان پپتیدهای ضد میکروبی محافظت می کند. داده های اولیه نشان می دهد که یک مکمل گیاهی تجاری، Nozevit®، ممکن است سلامت زنبور را با کاهش بارهای اسپور کلنی بهبود بخشد.

تحقیقات بیشتر و حجم نمونه بزرگتر برای تأیید این نتایج مورد نیاز است، همانطور که ون دن هیور و همکاران. هیچ اثری از Nozevit® در آزمایشات قفس گزارش نشد. یک بررسی 2 ساله از مکمل HiveAlive™ مبتنی بر جلبک دریایی کاهش بارهای اسپور کلنی و افزایش جمعیت کندو را نسبت به گروه شاهد پس از تجویز دو تیمار دو سالانه گزارش کرد. با کمال تعجب علیرغم اینکه نویسندگان در تجزیه و تحلیل قدرت کندو، مرگ و میر کلنی ها را توضیح می دهند، در این مطالعه درباره بقا اظهار نظر نشده است.

اگرچه برخی از عصاره های طبیعی و مکمل های تجاری در برابر N. ceranae اثربخشی نشان داده اند، مکمل های طبیعی دیگری نیز وجود دارند که به عنوان ضد عفونت تبلیغ می شوند که هیچ اثر مفیدی بر زنبورهای عسل آلوده به N. ceranae ندارند.Nosestat® و Vitafeed Gold® در یک کارآزمایی میدانی مورد ارزیابی قرار گرفتند و مشخص شد که هیچ تأثیری بر بهره‌وری کلنی و سطوح اسپور Nosema ندارند.

ApiHerb® و Nonosz® نیز برای بهبود سلامت زنبور عسل و شاید درمان نوسموزیس فروخته می‌شوند، اما تحقیقات بیشتر و شواهد علمی بیشتری برای حمایت از ادعاهای اثربخشی مورد نیاز است. بدیهی است که زنبورداران باید مراقب باشند که کدام مکمل ها و عصاره ها را برای درمان عفونت N. ceranae انتخاب می کنند.مکمل های میکروبی تجویز مکمل های میکروبی ممکن است اثرات مثبتی بر سلامت زنبور عسل داشته باشد و زنده ماندن N. ceranaeرا مختل کند.

"Baffoni و همکاران" پیشنهاد می کنند که مکمل رژیم غذایی زنبور عسل با سویه های بیفیدوباکتری و لاکتوباسیل که متابولیت های آنتی بیوتیکی ترشح می کنند، سطح اسپور N. ceranae را کاهش می دهد. این کار به مطالعات قبلی اضافه می کند که نشان می دهد اسیدهای آلی و سایر متابولیت ها (به عنوان مثال، سورفاکتین) تولید شده توسط باکتری ها باعث کاهش مرگ و میر زنبورها و بار N. ceranae  در هنگام تغذیه زنبورهای عسل می شود.

سایر سویه‌های باکتریایی و پروبیوتیک‌ها  Parasaccharibacter apium، Bacillus sp ، Bactocell® ، و Levucell SB بقای زنبورهای آلوده را بهبود می‌بخشند اما بار اسپور را کاهش نمی‌دهند. یک درمان موفق ضد نوزما باید تواما سلامت زنبور را بهبود بخشد و سطح عفونت را کاهش دهد.

انتخاب پروبیوتیک ها، پری بیوتیک ها و جایگزین های گرده ممکن است در واقع عفونت را تشدید کند و مرگ و میر زنبورها را افزایش دهد. روش‌های جایگزینی که قبلاً توضیح داده شد احتمالاً نسبت به مکمل‌های میکروبی برای زنبورداری امیدوارکننده‌تر و قابل استفاده‌تر هستند.

نتیجه مطالعات آزمایشگاهی و میدانی اخیر نتایج دلگرم‌کننده‌ای را گزارش می‌دهند که نشان می‌دهد ترکیبات منفرد RNAi، عصاره‌های طبیعی و مکمل‌ها ممکن است N. ceranae را مختل کرده و سلامت کلنی را بهبود بخشد. مهم است که محققان به آزمایش عوامل جدید برای فعالیت ضد میکروسپوریدی علیه نوسموز ادامه دهند.